Geneticky editovaný ječmen

V Laboratoři růstových regulátorů v Olomouci (LRR) využitím moderní metody CRISPR/Cas9 vyvinuli linii jarního ječmene se zkráceným stéblem, která by mohla být odolnější proti poléhání. Na detaily jsme se zeptali autorů výzkumu Ing. Ludmily Ohnoutkové, Ph.D., a Mgr. Tomáše Vlčka, Ph.D., z LRR, společného pracoviště Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Ústavu experimentální botaniky Akademie věd ČR, v. v. i.

Jak byste jednoduše vysvětlili, co je CRISPR/Cas a jak se liší od „klasického GMO“ přístupu?

Tomáš Vlčko: Metoda CRISPR/Cas je moderní nástroj, oceněný Nobelovou cenou, který byl adaptován z bakteriálního imunitního systému. Umožňuje nám velmi přesně a cíleně provádět změny (modifikace) na téměř jakémkoliv místě v genomu rostliny. Předpokladem je samozřejmě znalost genomu dané plodiny, což díky rostoucímu množství osekvenovaných genomů dnes již není problém. U klasického GMO se do rostliny vkládají cizorodé geny, například z bakterií, které tam zůstávají. U naší editované rostliny jsme pomocí CRISPR/Cas provedli pouze drobnou, cílenou mutaci a následně jsme zajistili, aby v ní nezůstala žádná cizorodá DNA. Rostlina se tak liší od původní odrůdy jen jedinou změnou, podobnou těm, které vznikají v přírodě přirozeně.

 Jaká je role genu PIL1 u ječmene?

Ludmila Ohnoutková: Dlouhodobě spolupracujeme s profesorem Peterem Heddenem z proslulého institutu Rothamsted Research v Anglii, který se specializuje na geny regulující růst rostlin. Právě on nám vytipoval gen PIL1 jako zajímavého kandidáta. Tento gen řídí další geny odpovědné za prodlužování internodií, tedy částí stébla mezi kolénky. Předpokládali jsme, že jeho úpravou (mutací) dojde ke zkrácení stébla. To jsme si nejprve ověřili v režimu uzavřeného nakládání ve skleníku, kde byly naše editované rostliny skutečně o 10 cm nižší. A kratší, stabilnější rostlina je logicky odolnější proti poléhání. Proto jsme zahájili polní pokus, abychom tuto hypotézu ověřili i v reálných podmínkách.

Jak přesně taková úprava genu probíhá?

Tomáš Vlčko: Proces začíná transformací, kdy do nezralých embryí ječmene vneseme pomocí upravené bakterie (Agrobacterium tumefaciens) genetickou informaci pro „molekulární nůžky“ CRISPR/Cas9. V této fázi rostlina dočasně obsahuje cizí, bakteriální geny, a je tedy klasickým GMO. Tyto „nůžky“ navedeme na přesné místo v genu PIL1, kde vytvoří zlom v DNA. Rostlina se tento zlom snaží přirozeně opravit, ale někdy při tom udělá malou chybu – a právě to je ta cílená mutace, kterou chceme. V našem případě vznikly dvě linie, jedna s vloženou jednou bází a druhá se ztrátou dvou bází DNA. Z těchto buněk pak v laboratoři regenerujeme celé rostliny. Následně v další generaci se přirozeným štěpením (segregací) odstraní gen pro samotné „nůžky“ CRISPR/Cas. Výsledkem je netransgenní rostlina, která neobsahuje žádné cizí geny, pouze mutaci v cílovém genu, jenž je vyřazen z funkce.

Jak se vám podařilo získat jako prvním v EU povolení pro polní pokus s editovaným ječmenem?

Ludmila Ohnoutková: V současné době legislativa Evropské unie stále nahlíží i na takto editované rostliny jako na GMO. Proto jsme museli projít standardním povolením u Ministerstva životního prostředí, které posuzuje Komise pro nakládání s GMO. Museli jsme podat žádost s řadou příloh, včetně havarijního plánu, provozního řádu, hodnocení rizika, a splnit přísné podmínky, například pěstovat ječmen minimálně 50 metrů od jiných porostů ječmene. Protože jsme již v minulosti realizovali pětileté polní pokusy s GMO ječmenem, měli jsme s psaním žádosti zkušenosti. Musím ale říci, že schvalovací proces byl tentokrát velmi rychlý a ministerstvo nám vyšlo vstříc, takže jsme stihli vyset ještě na jaře. Jsme tak opravdu první v EU, kdo editovaný ječmen v polních podmínkách testuje.

 Co přesně na poli sledujete a jaké jsou další plány?

Tomáš Vlčko: V rámci čtyřletého experimentu budeme sledovat růstové parametry. Zaznamenáváme fenologické fáze, jako je datum odnožování či metání, a porovnáváme výšku rostlin s kontrolou. Dále budeme hodnotit výnosové a kvalitativní parametry: počet odnoží, velikost klasu, počet a hmotnost zrn a podobně. Klíčovou součástí experimentu je také křížení naší nové linie s elitními českými odrůdami, na čemž spolupracujeme s Výzkumným centrem SELTON, s. r. o.

Jaký je tedy hlavní přínos vašeho výzkumu pro zemědělce a šlechtitele?

Ludmila Ohnoutková: Je důležité zdůraznit, že provádíme základní výzkum. Ověřujeme, že metoda CRISPR funguje a že jsme schopni cíleně a rychle vyvinout rostlinu s požadovanou vlastností. Celý proces od transformace po získání stabilní, netransgenní homozygotní linie nám trval pouhé tři roky, což je obrovské zrychlení. Šlechtitelům tak můžeme nabídnout ověřený genetický materiál se zajímavým znakem. Tomáš Vlčko: Cesta na pole je ale ještě dlouhá. Pro transformaci totiž musíme používat starou skotskou odrůdu Golden Promise z 60. let, která jako jedna z mála umožňuje tento složitý laboratorní proces transformace. Je to takový „trabant“ mezi ječmeny. V současné době nový znak vzniklý mutací je nutné křížením vnést do moderních výkonných odrůd, což trvá dalších několik let klasického šlechtění. Přímý přínos pro zemědělce je tedy zatím vzdálený, dokud nebude možné editovat přímo elitní odrůdy.

 Váš výzkum jasně ukazuje potenciál nových genomických technik. Co by podle vás nejvíce pomohlo jejich rychlejšímu zavedení do praxe?

Ludmila Ohnoutková: Limitující je pro nás evropská legislativa, která nerozlišuje mezi klasickým GMO a precizní editací genomu. Evropská komise již navrhla rozdělit editované rostliny do dvou kategorií. V té první by byly rostliny s malým počtem změn (do 20 modifikací), které mohou vznikat i přirozeně, a ty by nepodléhaly přísné GMO regulaci. Pokud tento návrh projde, obrovsky by to zjednodušilo a zlevnilo výzkum i následné využití. Klíčová je také osvěta veřejnosti, aby lidé rozuměli, že se nejedná o vkládání cizích genů, ale o precizní šlechtění. Nedávný průzkum ukázal, že česká veřejnost je v této oblasti zmatená a často si myslí, že transgenní plodiny jsou povolené, zatímco ty vzniklé mutací zakázané, přičemž realita je přesně opačná.*

Úvodní fotografie: Ing. Ludmila Ohnoutková, Ph.D., a Mgr. Tomáš Vlčko, Ph.D., z LRR, společného pracoviště Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Ústavu experimentální botaniky Akademie věd ČR, v. v. i. Foto Jana Pančíková