Karanténní bakteriózy - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) a Ralstonia solanacearum (Rs) jsou v současné době problémovou záležitostí pro mnohé pěstitele brambor. Charakter a projevy poškození těmito patogeny byly již na stránkách tohoto časopisu detailně popsány. Co však předchází tomu, než se zjistí, zda jsou bakterie v bramborové hlíze přítomny, chce nastínit tento článek.
Laboratorní kontrole na karanténní bakteriózy (KBB) podléhá veškerý v tuzemsku vyrobený rozmnožovací materiál bramboru základních kategorií (SE1, SE2, Elita), tuzemská certifikovaná sadba (C1 a C2) a zároveň veškerá sadba dovozových brambor z těch zemí, ve kterých se vyskytují sledované KBB, nesadbové brambory pak z oblastí zamořených KBB nebo ze zamoření podezřelých a veškeré konzumní brambory určené pro vývoz.. Při kontrole na hnědou hnilobu se dále testují rostliny rajčete a vody pro zajištění průzkumu.
Vzorky sadbových brambor odebírá semenářská inspekce ÚKZÚZ v souladu se směrnicemi EU. Za standardní vzorek je považováno 220 hlíz při hmotnosti partie brambor do 25 tun nebo při výměře do dvou hektarů. Odběry sadbových brambor nejsou možné dříve než tři týdny po úplném zničení natě (chemicky nebo mechanicky). Vzorky brambor jsou odebírány do polypropylénových nebo jutových pytlů. Pytle se označí řádně vyplněnou návěskou a štítek se shodnými údaji se rovněž vkládá dovnitř. Vzorky sadbových brambor doručí na svůj náklad žadatel (množitel) v co nejkratší době do laboratoře Výzkumného ústavu bramborářského v Havlíčkově Brodě.
Vzorky nesadbových brambor, pro účely vývozu a průzkumu, nebo vzorky sadbových popřípadě i nesadbových brambor při kontrole dovozů, odebírají pracovníci okresních oddělení Státní rostlinolékařské správy (SRS) podle regionální příslušnosti. Na náklady a prostředky SRS odvážejí vzorky do diagnostických laboratoří v Havlíčkově Brodě (oblast východních Čech, okresy Jihlava, Třebíč a Žďár nad Sázavou), Táboře (oblast jižních Čech) a Terezíně (oblast středních, západních a severních Čech a Moravy s výjimkou okresů Jihlava, Třebíč a Žďár nad Sázavou).
V diagnostických laboratořích jsou vzorky přijaty, zaevidovány, umyty a není-li nutný okamžitý rozbor (vývozy), jsou inkubovány při pokojové teplotě a zhruba 80% vlhkosti pro namnožení bakterií a snazší identifikaci i slabě napadených hlíz. Po umytí každého vzorku následuje mytí pračky za použití dezinfekčního prostředku. Pokud není prováděna inkubace, nechá se umytý vzorek řádně oschnout (přes noc) a teprve potom následuje další testování.
Odběr pletiva z hlízy. K odběru se používají speciálně přizpůsobené škrabky nebo nože, řádně mechanicky očištěné a vydezinfikované. Z hlízy se odstraní epidermální vrstva pokožky v oblasti pupku, která se odloží a později shromáždí v kontejneru na karanténní odpad. Následuje drobný výkroj pletiva obsahující svazek cévní. Všech 200 vykrojených segmentů (20 hlíz je jako záloha pro hlízy mechanicky poškozené nebo silně napadené jinými patogeny, takže je nelze pro rozbor použít) se soustřeďuje v kádince se sterilním pufrem ke zpracování do 24 hodin. Není-li to možné, pak je nutné zamrazení při teplotě – 20 C po dobu nejvýše 14 dnů.
Vizuální vyšetření na příznaky KBB. Po odebrání výkrojů z pupkového konce hlíz se každá hlíza rozřízne napříč a prohlédne se, jestli vykazuje příznaky typické pro KBB. Rozkrojené hlízy zmáčkneme a sledujeme, zda je z oblasti vodivých pletiv vytlačována nebo samovolně vytéká macerovaná hmota. Prvním příznakem je slabá sklovitost bez měknutí pletiv v okolí svazků cévních, zejména v oblasti pupku. Svazky cévní v pupkové oblasti hlízy mohou být nepatrně tmavěji zbarveny než okolní pletiva. Prvním dobře identifikovatelným příznakem je žlutavé zabarvení svazků cévních a výtok sýrovité hmoty našedlé nebo bílé barvy při stisknutí hlízy. V tomto stadiu mohou vodivá pletiva hnědnout a s postupující infekcí dochází k jejich destrukci, kdy vnější korová vrstva se oddělí od vnitřní korové vrstvy, vzniká kroužek. V pokročilých stadiích infekce se mohou objevit na povrchu hlízy prasklinky, které na svých okrajích bývají načervenalé, v případě Rs dochází k výronu bakteriálního slizu v oblasti oček, kde se ně něj nalepí částečky zeminy, což je pro tuto chorobu charakteristické. Zároveň může dojít k sekundárnímu napadení jinými bakteriemi nebo houbovými chorobami, při kterém jsou příznaky KBB maskovány a není možné je rozlišit od jiných chorob bramboru. Stejným postupem se při vizuálním vyšetření řídí i terénní pracovník SRS, popřípadě ÚKZÚZ, při kontrole hlíz v bramborárně nebo před sklizní na poli.
Příprava suspenze. Segmenty, které jsou uloženy ve sterilním pufru, se homogenizují tyčovým mixerem, homegenizát se dále filtruje a centrifuguje, vše podle metodiky. Výsledkem těchto pracovních procesů je jeden mililitr suspenze, který se rozdělí do třech mikrozkumavek - 500 l se uchovává v laboratoři pří – 20 C pro případ odvolacího řízení. První ze zbývajících dvou mikrozkumavek obsahu 250 l se využije pro přípravu IF testu, druhá v případě pozitivního nálezu IF testu k přípravě testu patogenity.
Část suspenzí připravovaných laboratoří VÚB Havlíčkův Brod, která zpracovává veškerou sadbu s určením pro IF testy, je jedenkrát týdně kurýrně v termoobalu převezena do DL Tábor, DL Havlíčkův Brod si suspenze odebírá denně. Suspenzi lze přechodně (nejvýše však 24 hodin) uchovat v chladničce při 4 C.
Příprava IF testu. Na jedno desetijamkové podložní sklíčko, na kterém vlastní sérologický test probíhá, se aplikuje vždy pouze jeden vzorek a negativní kontrola.V horní části sklíčka je test na Cms, v dolní Rs test, v první jamce je pouze pufr (negativní kontrola). Používají se séra z dovozu, pro Cms od firmy Agdia z USA a pro Rs jednak německé sérum Löve a sérum firmy Adgen ze Skotska. Kontrolami jsou mezinárodně používané kmeny uchovávané ve formě lyofilizátů bakteriologickým oddělením VÚRV Praha - Ruzyně. V každé laboratoři jsou zaškoleni minimálně dva pracovníci, kteří vyhodnocují IF testy. IF pozitivní sklíčka jsou uchovávána v temnu a v chladu a jsou zajištěna proti vyschnutí.
Test patogenity. V případě IF pozitivního nálezu je zakládán test patogenity. Pro tento biolgický test na Cms se používá jako testovací rostlina lilku vejcoplodého (Solanum melongea cv. Black Beauty). Rostliny musí být ve fázi druhého pravého listu a očkovaní podezřelé suspenze na 25 testovaných rostlinách se provádí podle popsaných metodik. Stejným způsobem se odděleně infikuje 25 rostlin známou kulturou Cms (pozitivní kontrola) a 25 rostlin sterilním pufrem (negativní kontrola). Každá rostlina v kontejneru je označena stejným pořadovým číslem, pod jakým vzorek absolvoval všechny testy od přijetí do této fáze rozboru. Rostliny se pěstuji při délce dne 14 hodin, intenzitě osvětlení 10 000 lux, denní teplotě 21 - 24 C a noční 15 C. Bakterie Cms omezují růst při teplotách přes 30 C. Symptomy se sledují v osmi denních intervalech po dobu 40 dní.
Pro testování Rs se používá deset testovacích rostlin náchylných semenáčků rajčete cv. Moneymaker nebo opět lilku stejného kultivaru jako u Cms. Rostliny se nechávají růst při teplotách 22 – 28 C bez poklesu teplot během noci, při vysoké relativní vlhkosti (80 %) a sledují se po dobu čtyř týdnů.
V případech IF pozitivních vzorků je možné provést metodu inkubace a následně provést rozkroje nebo i novou suspenzi. Tento postup se doporučuje dodržet, neprojeví-li se příznaky Cms na testovací rostlině do třiceti dní od doby očkování.
Reizolace KBB. K tomu, aby mohl být výsledek rozboru uzavřen, zbývá z testovaných rostlin lilku vykazujících příznaky napadení bakterii izolovat a identifikovat. Pokud rostliny příznaky nevykazují, odeberou se pletiva nejméně ze čtyř rostlin. Vlastní inkubace patogena se provádí na některém ze selektivních nebo semiselektivních medií a probíhá v případě Cms při teplotě 21 C až dvacet dní, neboť Cms je pomalu rostoucí bakterií. Bakterie jsou identifikovány na základě IF testu nebo nutričních a fyziologických testů a následném testu patogenity na lilcích. Všechny tyto testy musí obsahovat pozitivní kontrolu.
Z rostlin, které vykazují charakteristické příznaky Rs, se odeberou části pletiv zhruba ve vzdálenosti 2 cm od místa vpichu při inokulaci a opět se připraví roztěry na speciální, většinou semiselektivní média. Provádí se inkubace při 27 C a následuje determinace narostlého inokula jedním z následujících testů: IF test, enzymatický test, test ELISA, PCR, FISH, proteiny, mastné kyseliny. Získané kultury Rs se opět potvrdí testem patogenity. Uvedené diagnostické laboratoře nemají všechna potřebná zařízení pro výše uvedené testy, které, je-li třeba, provádí bakteriologické oddělení (referenční laboratoř) VÚRV v Praze. Rovněž dojde-li k nějakému spornému nebo netypickému nálezu, je poskytnut veškerý materiál této laboratoři, která provede další testy a potvrdí s konečnou platností buď pozitivní, nebo negativní výsledek provedeného testu.
Příprava veškerých pomocných a pracovních roztoků, suspenzí a jednotlivých medií je ve shodě s používanými metodikami (metodický pokyn B/KAR/2/1999 k ochraně proti šíření původců bakteriální kroužkovitosti bramboru (BKB) a bakteriální hnědé hniloby (BHH) /SRS č. j. 4323a/99/Ř-10 a Věstník MZe ČR č. 1/2000). S veškerým odpadem při testech na KBB je zacházeno tak, aby nedošlo k šíření karanténních chorob a zároveň nemohla být infekce přenesena z jednoho vzorku na druhý v žádné fázi probíhajícího testování.
Negativní i pozitivní výsledek IF testu každé testované partie musí pověřená laboratoř odeslat odběrateli vzorku písemně formou protokolu o rozboru vzorku do jednoho pracovního dne od ukončení testu. Odběratel, po obdržení protokolu zaslaného příslušnou laboratoří,
oznámí výsledek rozboru opět písemně majiteli nebo množiteli nejpozději do 48 hodin.
RNDr. Věra Humpolíčková,
Státní rostlinolékařská správa, Praha,
Diagnostická laboratoř,
Havlíčkův Brod
