Identifikace odrůd brambor pomocí metody RAPD

Na brambory jakožto potravinu se vztahuje zákon o potravinách (zákon č. 306/2000 Sb.) a navazující vyhlášky Ministerstva zemědělství ČR. Vyhláška stanovuje, pod jakým názvem mohou být brambory prodávány – brambory konzumní a brambory konzumní rané, u dovážených brambor je povinností označit odrůdu a zemi původu. U konzumních brambor pozdních musí být uveden varný typ a odrůda, u konzumních brambor raných též barva dužniny a tvar hlíz.

Kromě zákona o potravinách se na odrůdy brambor vztahuje Zákon č. 418/2000 Sb. o ochraně práv k odrůdám rostlin. Tento zákon upravuje práva a povinnosti k novým odrůdám rostlin, dále upravuje pravomoc a působnost orgánů vykonávajících státní správu v oblasti ochranných práv k odrůdám, řízení o udělení ochranných práv, kontrolu udržování odrůd a ukládání sankcí za nedodržení povinností stanovených tímto zákonem.
S přihlédnutím k výše uvedeným faktům vyvstává nutnost identifikace, verifikace a kontroly pravosti odrůd u brambor. V současnosti jsou odrůdy popsány s využitím morfologických a hospodářských znaků. Pro přesnou a rychlou identifikaci neznámého vzorku se však tato charakteristika jeví jako nedostatečná, zejména proto, že morfo-fyziologické znaky rostlin a hlíz nejsou zcela objektivní pro jejich závislost na podmínkách prostředí.
S pokroky v molekulární biologii je zaváděna řada molekulárních a biochemických technik, které se staly účinným nástrojem stanovení genetické rozdílnosti, a proto umožňují charakterizaci genotypů. Mezi prvními byly vyvinuty techniky založené na polymorfismu proteinů. Nevýhodou analýzy polymorfismu zásobních bílkovin je to, že jsou dostupné pouze pro limitované množství genů a jsou ovlivněné stadiem rostliny (Desborough, 1968). Výhodou naopak je, že metoda je jednoduchá, rychlá a poskytuje výsledky do 24 hodin.
Jiným přístupem je identifikace založená na DNA markerech. DNA marker je polymorfní oblast na sekvenci DNA, která je ve vazbě s určitou vlastností. Pomocí DNA markerů je možné stanovit rozdíly v genetické informaci, jinak řečeno DNA markery jsou založeny na polymorfismu DNA sekvencí nesených dvěma nebo více jedinci. Polymorfismus DNA je možné odhalit pomocí řady metod.
Jednou z nich je metoda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA = náhodně amplifikovaná polymorfní DNA). Metoda RAPD umožňuje odhalit polymorfismus i v regionech DNA, u nichž není známá sekvence, funkce nebo lokalizace na chromosomu. Tato vlastnost je velkou výhodou této techniky. Metoda RAPD je založena na amplifikaci genomové DNA metodou PCR (polymerázová řetězová reakce) s využitím krátkých oligonukleotidů (obvykle dekamerů) náhodné sekvence. Výsledkem tohoto procesu je vznik variabilních amplifikačních produktů, které tvoří na elektroforeogramu charakteristický obraz a ten je možné hodnotit (Penner, 1996).
Variabilita zjištěná pomocí RAPD je poměrně vysoká, bez znalosti sekvence se analyzuje velký počet lokusů v jednom vzorku, přičemž dědičnost analyzovaných znaků je dominantní. Výhodou metody je bezesporu snadnost, rychlost a technická nenáročnost. Velkým pozitivem metody proti analýze bílkovin je možnost identifikace vzorku v jakémkoli stadiu vývoje. Zřejmě proto je metoda hojně používána při identifikaci a studiu genomů různých druhů kulturních rostlin, například rýže (Martin et al., 1997), pšenice (Zhang et al., 1996), rajčat (Rom et al., 1995), fazolí (Bai et al., 1997), mrkve (Nakajima et al., 1997) a jiných. Využití se samozřejmě nevyhýbá ani druhu Solanum tuberosum. U něho je tato technika rozvíjena řadu let.
Mezi první publikace o úspěšném využití RAPD při identifikaci odrůd je možné zařadit práce Demeke et al. (1993) nebo Hosaka et al. (1994). Brzy poté se „fingerprinting“ stává součástí celkové charakteristiky nově zaváděných odrůd (Lynch et al., 1994). Metodu využili Paz a Veilleux (1997) při studiu genetické vzdálenosti mezi genotypy monoploidů odvozených od S. phureja a diploidními heterozygotními „otcovskými“ rostlinami. Rasmussen et al. (1997) použili RAPD analýzu k charakterizaci interspecifických asymetrických hybridů rodu Solanum. Mandolino et al. (1996) se zabývali stabilitou charakteristiky RAPD u bramboru porovnáváním výsledků získaných u hlíz a mikrohlízek. U mikrohlízek autoři pozorovali odchylku (1 band) od výsledků získaných u hlíz. Tento rozdíl vysvětlují jako možnou variaci specifickou pro mikrohlízky.
V podmínkách naší republiky dosud nebyly tyto metodiky u brambor propracovány natolik, aby se mohly rutinně používat v praxi. Přitom je identifikace pomocí genetických markerů velmi žádaná. Na tuto potřebu jsme reagovali. Již druhým rokem je problematika využití RAPD k identifikaci odrůd brambor řešena v rámci projektu NAZV EP 9111.
Metoda RAPD byla aplikována na třicet odrůd, mezi kterými jsou zastoupeny odrůdy různého směru využití (konzumní i průmyslové) a různé délky vegetační doby:
– velmi rané: Karmela, Koruna, Krasa, Krystala, Satina, Vera, Rosara a Impala,
– rané: Karin, Kobra, Kreta, Veronika, Vilma, Secura a Dali,
– polorané: Keřkovské rohlíčky, Korela, Krista, Tara, Velox, Vladan, Granola a Folva,
– polopozdní: Amylex, Javor, Ornella, Pacov, Zlata, Saturna a Asterix.
Po izolaci DNA byla uskutečněna amplifikační reakce podle námi zoptimalizovaných podmínek (Polzerová, Ptáček, 2000) se šesti primery. Čtyři primery byly převzaty z dostupné literatury (308, 131, 184, SC10-4), dva byly náhodně zvoleny (P71, P72). Po amplifikaci následovala elektroforéza v agarozovém gelu, dále obarvení EtBr (ethidium bromid) a statistické vyhodnocení. Data byla získána určením přítomnosti (1) či absence (0) produktu RAPD na gelu. Podobnost takto popsaných odrůd byla počítána pomocí Jaccardova koeficientu (1908). Na základě těchto výsledků byla provedena klastrová analýza pomocí UPGMA metody (unweighted pair group average). Statistické výpočty byly uskutečněny pomocí softwaru SPSS Base +. Pro vytvoření představy je v tabulce uveden příklad takového vyhodnocení u odrůd Impala, Karin, Granola a Ornella pro primer 131. Na obrázku je příklad schematického vyjádření RAPD produktů po elektroforetickém rozdělení.
Polymorfismus byl pozorován u vybraných 30 kultivarů při amplifikaci DNA pomocí kteréhokoliv ze šesti primerů použitých v této studii. Velikost amplifikovaných DNA fragmentů se pohybovala v rozmezí 178 až 1847 páru bazí. Primery SC10-4 a P72 vedly k nejvyššímu polymorfismu a každý z nich jednoznačně rozlišil 15 odrůd. Primer 308 rozlišil deset odrůd a použití primeru 131 umožnilo identifikovat osm kultivarů. Společně primer SC10-4 a P72 rozlišili 29 vybraných odrůd. Sada náhodně vybraných primerů do reakce RAPD je schopna rozlišit uvedené odrůdy, z čehož vyplývá značný potenciál této metody pro rozlišování a identifikaci odrůd bramboru.
Ačkoli některé primery produkují většinu bandů shodných (například P71), tak produkty reakce RAPD za použití jiných primerů (například SC10-4, P72, 308) jsou značně polymorfní a vhodné pro identifikaci. Celkem bylo s použitím šesti primerů amplifikováno 66 produktů, z toho 46 bylo polymorfních. Většina polymorfních, náhodně amplifikovaných produktů může být tvořena u jednoho nebo více kultivarů. Skutečnost, že polymorfní produkt byl přítomen pouze v jednom případě, se v našich datech nevyskytovala. Nejnižší sledovaný počet produktů se rovnal šesti u primeru SC10-4 (fragment o velikosti 898 pb), poměrně častým jevem byla nepřítomnost pouze jednoho bandu. Například u primeru SC10-4 byl tímto bandem u odrůdy Asterix produkt o velikosti 341 pb, dále byl tento jev pozorován u odrůdy Folva za použití primeru 308 (224 pb) nebo u odrůdy Zlata a primeru 131 (233 pb).
Pokud se týká přesnosti a reprodukovatelnosti výsledků, je možné napsat, že ve většině případů byly výrazné produkty opravdu stabilní. Nicméně je nutné podotknout, že jsme se u některých primerů setkali s určitou variabilitou (šlo zejména o produkty extrémních velikostí, pod 250 pb a nad 1500 pb), která se projevila buď mizením některých produktů při následném opakování, nebo změnou spektra amplifikovaných produktů (tzn. amplifikovaly se vždy shodné produkty, ale různě intenzivně, což se projevilo změnou celkového vzhledu gelu po obarvení). Toto se výrazně projevilo například u primeru 184. Na tento problém naráží ve svých pracích řada autorů, například van Eck et al. (1995), Demeke et al. (1993) nebo Hallden et al. (1996). Tento jev je vysvětlován méně efektivní amplifikací sekundárních a terciálních produktů, což může být následek chybného nasednutí nebo slabší vazby primerů v úvodu reakce k jednomu či více místům, a tak je ovlivněn celý průběh reakce (Demeke et al. 1993).
Abychom se přesvědčili o reprodukovatelnosti metody, provedli jsem experiment, ve kterém jsme ověřili stabilitu RAPD produktů. Ověřili jsme, že různé vzorky DNA stejné odrůdy amplifikují shodné RAPD produkty. Experiment byl prováděn na sedmi vybraných odrůdách (Impala, Keřkovské rohlíčky, Saturna, Asterix, Granola, Vilma, Kreta) s využitím čtyř RAPD primerů (P 72, SC10-4, 308, 131), které v předchozích experimentech poskytovaly největší variabilitu. Do reakce byla zařazeny vždy dva vzorky (dva jedinci téže odrůdy) čerstvě izolované DNA a vzorky DNA ze starších zásob. Výsledkem bylo zjištění, že mezi vzorky DNA dané odrůdy izolovanými metodou Dneasy nebyl rozdíl a RAPD reakce poskytovala pro daný kultivar shodné produkty. Zároveň jsme otestovali, že výsledek dvou nezávislých reakcí je totožný (reakce samostatně namíchané). Tím jsme prokázali reprodukovatelnost metody.
Závěrem, po otestování části spektra povolených odrůd v ČR se zaměřením na české odrůdy. Můžeme konstatovat, že rozlišování odrůd pomocí RAPD se jeví jako možné. Výsledky analýzy jsou dostupné do 48 hodin. Velkou předností je zejména skutečnost, že identifikace může být uskutečněna v jakémkoli stadiu vývoje rostliny, protože k analýze je možné použít jak nadzemní části, tak hlízy. Tato problematika bude dále řešena aplikací RAPD metody na současný sortiment odrůd brambor povolených v ČR.

Mgr. Hana Polzerová,
Výzkumný ústav bramborářský
Havlíčkův Brod, s.r.o.

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *